In 1581 besloot de Utrechtse vroedschap de boeken van de in de stad aanwezige kapittels en kloosters samen te brengen. Zo sloot ook Utrecht zich aan bij de vele steden die na de Reformatie een goede openbare bibliotheek vormden voor de eigen burgers, vaak ook met het oog op de oprichting van een hogeschool. De feitelijke overbrenging van deze katholieke collecties verliep niet zonder vertragingspogingen vanwege de toenmalige bezitters. Nogal wat boeken en handschriften zouden in de 19de eeuw pas in de UB terechtkomen. De collectie leidde een sluimerend bestaan, ondanks de inlijving van twee belangrijke legaten: de privé-bibliotheken van Mr. Evert van de Poll (800 á 1000 banden) en van de voormalige kanunnik Huybert Edmond van Buchell (3000 titels). In 1608 verscheen de eerste gedrukte catalogus, samengesteld door enkele predikanten. De oprichting van een Illustere School (1634) en kort daarna van de Universiteit (1636) noopten ook tot een afzonderlijke functie van bibliothecaris, voorheen door de koster uitgeoefend. Cornelis Booth (1605-1678) werd in 1637 de eerste echte bibliothecaris. In 1664-1670 verscheen een tweede catalogus van de collectie. Van 1678 tot 1740 stond de bibliotheek onder directie van een commissie uit de vroedschap. In 1718 verscheen een derde gedrukte catalogus. Van 1740 tot 1764 waren er twee hoogleraren bibliothecaris: Arnoldus Drakenborch en Petrus Wesseling, die in 1753 een Auctarium op de catalogus liet drukken. Hij werd opgevolgd door de oriëntalist Sebaldus Rau. In de Franse Tijd slaagde de bibliotheek erin te overleven zonder verlies van schatten. Onder Ph. W. van Heusde kende zij dan een echte expansie (1816-1839) en verhuisde in 1820 van de Janskerk naar de Wittevrouwenstraat; ook kreeg zij er een museale functie bij. In 1834-35 verscheen de eerste alfabetische catalogus. Van 1839 tot 1855 was A. van Goudoever de laatste hoogleraarbibliothecaris; van 1856-1878 was P.J. Vermeulen archivaris-bibliothecaris.